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        克倫特羅(瘦肉精)殘留檢測分析:在線凈化與固相萃取比較

         更新時(shí)間:2014-10-19 點(diǎn)擊量:2280

        在線凈化LC-MS/MS系統(tǒng)對動物組織中克倫特羅殘留的檢測分析


         

        http://www.thermo.com.cn/Resources/201104/29123547853.pdf

        作者:趙孔祥1 王海鑒2
        1. 天津出入境檢驗(yàn)檢疫局食檢中心;2. 賽默飛世爾科技( 中國) 有限公司

        克倫特羅俗稱瘦肉精,常被用作飼料添加劑以提高家
        畜的瘦肉含量,但由于其嚴(yán)重的毒副作用,歐盟于1988
        年1 月1 日起禁止鹽酸克倫特羅物質(zhì)當(dāng)飼料添加劑使用。
        1991 年被FDA 禁止。1997 年,中華人民共和國農(nóng)業(yè)部下
        文嚴(yán)禁β- 腎上腺素類激素在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用,鹽酸
        克倫特羅列為*位。2009 年7 月為應(yīng)對日、韓從我國食
        品中檢出鹽酸克倫特羅事件,質(zhì)檢系統(tǒng)確定了了更嚴(yán)格的
        出口判定標(biāo)準(zhǔn)(0.05μg/kg),食品檢測已經(jīng)進(jìn)入超痕量時(shí)代。
        在此背景下,我們需要更有效的前處理手段以便我們
        得到更加濃縮更加純凈的樣品來提高我們的信號降低我
        們的噪音。基于色譜原理的創(chuàng)新樣品制備方法——Turbo
        Flow 技術(shù)為我們提供了新的思路。這種在線自動過程處理
        技術(shù)結(jié)合了擴(kuò)散、化學(xué)和體積排除的原理,在捕獲感興趣
        分析物的同時(shí),快速消除基質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一個
        前處理簡單,選擇性靈敏度高的克倫特羅的Turbo Flow 實(shí)
        用在線凈化方法,并確定該方法的檢出限。
        1 實(shí)驗(yàn)部分
        1.1 樣品制備
        取5g 動物組織樣品與10mL 乙腈,10% 乙酸銨(1:3)
        混合溶液混勻勻漿10 分鐘,5000r/min 離心十分鐘取
        1mL 上清液經(jīng)過0.22μm 注射過膜,上機(jī)。
        1.2 Turbo Flow 條件
        系統(tǒng):
        Thermo Scientific Aria
        TLX-1 controlled by Aria. software
        在線凈化柱: Turbo Flow Cyclone MCX 0.5×50mm
        進(jìn)樣體積: 50μL
        上樣溶劑: 0.1% 的甲酸水溶劑
        上樣流速: 2mL/min
        洗脫溶劑: 1%的氨水甲醇溶液
        洗脫體積: 50μL
        1.3 HPLC 方法條件
        色譜柱:Hypersil GOLD aQ 3μm 100 X 2.1mm
        流路A :0.1% 的甲酸水溶液
        流路B :甲醇
        時(shí)間(min) A% B% 流速mL/min
        0 90 10 0.4
        1 90 10 0.4
        2.33 80 20 0.4
        2.83 60 40 0.4
        6 10 90 0.4
        6.5 10 90 0.4
        8 90 10 0.4
        1.4 質(zhì)譜條件
        1.4.1 調(diào)諧參數(shù)
        系統(tǒng) TSQ Ultra AM
        離子源極性: 正離子模式
        噴霧電壓: 4500V
        鞘氣壓(N2): 50arb
        輔助氣壓(N2): 16arb
        毛細(xì)管柱溫度: 350°C
        碰撞氣體(Ar): 1.5mTorr
        Skimmer offset 10V
        Q1/Q3峰分辨度: 0.7u (單位質(zhì)量)
        1.4.2 SRM 反應(yīng)參數(shù)
        被分析組分
        母離子
        (m/z)
        子離子
        (m/z)
        碰撞能量
        (V)
        管透鏡電壓
        (V)
        克倫特羅-D9 286 169.1 28 104
        克倫特羅277 132.2 29 94
        168.1* 28 94
        203.6 15 94
        * 為定量離子
        2 結(jié)果與討論
        食物樣品本身基質(zhì)比較復(fù)雜,在進(jìn)行檢測之前往往
        需要一個較長的樣品預(yù)處理過程。比如賈曉飛等使用酶
        解,高氯酸沉淀蛋白,邵兵等應(yīng)用HLB 和MCX 兩次SPE
        對食品中β2- 受體激動劑進(jìn)行殘留檢測都取得了很好的效
        果,這些方法的目的也都是為了獲得更加濃縮和純凈的樣
        品。應(yīng)用Turbo-Flow 在線凈化技術(shù)使得這些工作變得更加
        圖1 Turbo Flow 在線凈化與HPLC 聯(lián)用方法參數(shù)
        熱點(diǎn)聚焦 Hotspot
        簡潔方便,減少了中間步驟和偶然誤差,使得加標(biāo)回收的
        重復(fù)性很穩(wěn)定,0.05μg/kg 濃度下六平行RSD 為5.36% ;
        同時(shí)由于樣品更加純凈濃縮,干擾較少,此方法在添加量
        為0.02μg/kg 濃度下峰型良好( 如圖2 所示)。根據(jù)歐盟
        法規(guī)計(jì)算此方法檢出限(LOD) 為0.002μg/kg,定量限為
        0.006μg/kg 已經(jīng)能輕松應(yīng)對實(shí)際需要。同時(shí)如果有實(shí)際
        需要,可以采用更長的凈化柱(100mm 規(guī)格) 或者采用串
        聯(lián)凈化柱的方法進(jìn)一步增加樣品濃縮倍數(shù),來提高檢出限。
        由于采用了在線凈化系統(tǒng),進(jìn)入分析色譜柱的樣品也更
        圖2 0.02μg/kg 濃度色譜圖
        圖3 20pg/g 添加回收比較圖。左圖為MCX 固相萃取凈化,右圖為在線凈化結(jié)果
        為純凈,一定程度上降低了噪音和雜峰的產(chǎn)生。如圖3 所示,
        采用Turbo Flow 技術(shù)一定程度上起到了穩(wěn)定基線的作用。
        運(yùn)用Transcend 在線凈化系統(tǒng)的操作軟件Aria OS 的
        變量設(shè)置功能,可以方便設(shè)置批處理程序嘗試不同的洗
        脫溶液。在比較不同濃度的氨水甲醇溶液后,結(jié)果表明
        1% 的氨水甲醇溶液作為洗脫溶液的效果*。使用外
        標(biāo)法計(jì)算其與不經(jīng)過凈化柱的結(jié)果得到其回收率為
        79%~84%。而且此濃度的氨水甲醇溶液以0.2mL/min 的
        速度與0.4mL/min 的分析柱溶液混合不會對液相色譜
        產(chǎn)生不良影響,在使用此方法千針后,10 個平行的保留
        時(shí)間RSD 仍然只有0.1%。
        分別配置5pg/mL,10pg/mL,20pg/mL,50pg/mL,
        100pg/mL,200pg/mL,500pg/mL,1ng/mL,2ng/mL
        的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中都混有100pg/mL 內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)
        法定量得到標(biāo)準(zhǔn)曲線有很好的線性( 曲線見圖3),相關(guān)系
        數(shù)R2 為0.9995
        向5g 動物組織中分別添加100pg、250pg、500pg
        克倫特羅標(biāo)準(zhǔn),內(nèi)標(biāo)法定量,計(jì)算其回收率結(jié)果表明,經(jīng)
        過在線凈化和內(nèi)標(biāo)法校正后樣品回收率非常穩(wěn)定。簡單的
        前處理步驟帶來zui少的偶然誤差。
        表1 克倫特羅不同添加水平回收率
        添加水平平均回收率% RSD%*
        20pg/g 94.2 5.58
        50pg/g 96.5 5.36
        100pg/g 94.4 2.49
        * 為六平行水平下RSD 值
        3 結(jié)論
        采用Turbo Flow 在線凈化技術(shù)可以非常方便的按要求
        得到更加濃縮,干擾更少的樣品,提高了信噪比,降低了
        檢出限。
        Turbo Flow 圖4 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)曲線在線凈化技術(shù)簡化了前處理步驟,減少了
        熱點(diǎn)聚焦 Hotspot
        偶然誤差獲得了令人滿意的重現(xiàn)性。
        使用Aria OS 操作系統(tǒng),我們可以很方便的設(shè)置批處
        理變量,嘗試不同種類或者比例的上樣或者洗脫溶劑。
        4 參考文獻(xiàn)
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